Kontraindikácie spojené s kryokonzerváciou spermií býkov
2 Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Ústav aplikovanej biológie, Fakulta biotechnológie a potravinárstva
Prehľad o súčasnom stave danej problematiky
Príchod technológii krykonzervácie spolu s metódami umelej inseminácie priniesli revolúciu v chove hovädzieho dobytka po celom svete, vďaka zlepšeniu efektivity chovu, zvýšeniu fertilizačného potenciálu plemenných býkov a možnosti využitia ich kvalitného genetického materiálu za účelom inseminácie väčšieho počtu kráv. Kryobiológia patrí medzi multidisciplinárne vedy zaoberajúce sa štúdiom fyzikálnych a biologických procesov prebiehajúcich v bunkách a tkanivách pri nízkych tzv. kryogénnych teplotách (Benson a kol., 2012). Vôbec prvé pokusy spojené s kryoprezerváciou ejakulátu cicavcov sa datujú do roku 1784, kedy taliansky vedec Lazzaro Spallanzani použil v snehu chladený ejakulát psa a úspešne inseminoval sučku, ktorej sa narodili tri šteňatá. Neskôr v roku 1899, ruský biológ Ilja Ivanovič Ivanov vyvinul praktické metódy a protokoly umelej inseminácie hospodárskych zvierat. Avšak azda za najväčší míľnik v oblasti kryouchovávania spermií sa považuje rok 1940 kedy Phillips a Lardy využili vaječný žĺtok ako kryoprotektívne aditívum na ochranu spermií počas kryokonzervácie. O pár rokov neskôr v roku 1949, Polge a kol. potvrdili kryoprotektívne účinky glycerolu (Ombelet a Van Robays, 2015).
V porovnaní s ostatnými druhmi hospodárskych zvierat je v súčasnosti kryokonzervácia spermií býkov zvládnutá metodicky najlepšie. Aj napriek tomu, životaschopnosť spermií po rozmrazení klesá a medzi rôznymi plemenníkmi sa líši. Odstránenie týchto nedostatkov by znamenalo pokrok v oblasti krykonzervácie pre účely reprodukčných biotechnológií a zlepšenie kvality rozmrazených vzoriek pre účely umelej inseminácie (Ugur a kol., 2019). Procesy, ktoré sú zodpovedné za letálne alebo sub-letálne poškodenie spermií počas kryokonzervácie nie sú doposiaľ dostatočne vedecky podložené. Nízke tzv. kryogénne teploty, počas procesu mrazenia majú negatívny vplyv na kvalitatívne a kvantitatívne parametre spermií býkov. V konečnom dôsledku tieto zmeny vedú k poklesu pohyblivosti (motility), životaschopnosti, membránovej integrity, poškodeniu DNA až bunkovej smrti (apoptóze). Počas kryokonzervácie sú spermie vystavené rôznym fyziologickým a štrukturálnym zmenám. Medzi najčastejšie kontraidikácie spojené s kryouchovávaním bovinných spermií (Obr.) zaraďujeme tvorbu ľadových kryštálikov, oxidatívny stres, bakteriálnu kontamináciu, predčasnú kapacitáciu tzv. kryokapacitáciu a prípadné cytotoxické účinky kryoprotektantov (Singh a kol., 2014). Kryobiológia v súčasnoti zastáva dôležité miesto v reprodukcii hospodársky významných zvierat a preto je nutné neustále zlepšovať a vyvíjať nové protokoly a technológie, ktoré by zvýšili kvalitu kryokonzervovaných vzoriek po ich rozmrazení, čím by sa zvýšila úspešnosť umelej inseminácie.
Problémy súvisiace s kryokonzerváciou
Tvorba ľadových kryštálikov
Kryokonzervácia umožňuje dlhodobé uchovávanie živých buniek a tkanív. Pozastavenie metabolizmu a fyziologických aktivít buniek je spôsobené vplyvom nízkych teplôt počas mrazenia. Tento proces však môže spôsobiť nezvratné poškodenie buniek vedúce buď k nekróze alebo bunkovej smrti (Gao a Critser, 2000; Ozaydin a Celik, 2012) . Hlavným problémom nie je schopnosť buniek znášať skladovanie pri kryogénnych teplotách (pod -190 °C), väčšina komplikácii nastáva práve v rozmedzí teplôt od -130 °C po -15°C. Tento prechod medzi teplotami musia spermie zvládnuť dvakrát, raz počas zmrazovania a neskôr počas ich rozmrazovania (Ӧztürk a kol., 2019). Regulácia vody do alebo von z bunky počas mrazenia a rozmrazovania je riadená špeciálnymi proteínovými kanálikmi tzv. akvaporínmi (AQP). Mnohé z nich ako napr. AQP7, AQP8 a AQP11 boli identifikované aj na membráne spermií býkov. AQP7 zodpovedá za metabolizmus glycerolu, zatiaľ čo AQP8 je zodpovedný za výmenu vody v bunke (Yueng, 2010). Počas kryokonzervácie dochádza najskôr k tvorbe ľadových kryštálov vnútri bunky, čím sa zvyšuje množstvo extracelulárnej tekutiny mimo buniek. Pri rýchlom mrazení nastáva osmotická nerovnováha v dôsledku difúznej kryštalizácie ľadu v extracelulárnej tekutine. Tento jav má za následok zvýšenie tlaku, ktorý je tvorený ľadovými kryštálmi, pričom rozširuje subakrozomálnu oblasť spermie a poškodzuje lipidovú štruktúru membrán spermií, čo vedie k ich poškodeniu. Zmeny osmolarity a prítomnosť intracelulárnych ľadových kryštálov, vedú k zmenám v konsolidačnej architektúre proteínov a sacharidov, ktoré spôsobujú defekty membránových štruktúr a znižujú tak životaschopnosť spermií (Morris a kol., 2011; Hezavehei a kol., 2018).
Oxidatívny stres
Počas kryokonzervácie môže byť oxidatívny stres vyvolaný rôznymi mechanizmami ako sú osmotický stres, tepelný šok alebo zvýšený oxidatívny metabolizmus. V dôsledku nerovnováhy v produkcii reaktívnych foriem kyslíka (ROS) a antioxidačnou schopnosťou spermií, dochádza k rozvoju oxidatívneho stresu a indukcii poškodenia membrány spermií resp. výskytu zlomov DNA. Antioxidačné vlastnosti semennej plazmy v ejakuláte koexistujú spoločne so spermiami s cieľom regulovať intracelulárny redoxný potenciál, najmä za stresových podmienok, ktoré v tomto prípade predstavujú nízke teploty počas ich zmrazovania. Zvýšenie generácie ROS je výsledkom zmien v transportnom reťazci elektrónov v mitochondriách a NADPH oxidázy v plazmatickej membráne počas kryokonzervačného procesu (Len a kol., 2019). Práve preto sa oxidatívny stres považuje za jednu z hlavných príčin štrukturálnych a molekulárnych poškodení počas kryouchovávania spermií. Zníženie antioxidačného potenciálu spermií nastáva v dôsledku úplného odstránenia alebo zriedenia semennej plazmy pred samotným mrazením, pričom semenná plazma poskytuje spermiám prirodzenú antioxidačnú ochranu vo forme enzymatických aj neenzymatických antioxidantov. Ďalšou komplikáciou spojenou so zvýšenou produkciou ROS je peroxidácia lipidov. Membrány spermií sa vyznačujú relatívne vysokými koncentráciami polynenasýtených mastných kyselín, ktoré sú citlivé na peroxidáciu vyvolanú ROS po kryokonzervácii. Peroxidácia lipidov prebieha najmä v bičíku a strednom tzv. mitochondriálnom oddieli spermie kde sa nachádza aj hlavný respiračný aparát bunky. Tieto zmeny vedú k poškodeniu lipidovej vrstvy membrán, poklesu tvorby adenozíntrifosfátu (ATP), strate pohyblivosti a poškodeniu DNA (Tatone a kol., 2010; Ezzati a kol., 2020).
Bakteriálna kontaminácia
Prevalencia výskytu mikroorganizmov v ejakuláte tzv. bakteriospermia pôsobí nepriaznivo na funkciu spermií tým, že znižuje ich pohyblivosť, životaschopnosť, spôsobuje morfologické defekty, aglutináty a predčasne aktivuje akrozómovú reakciu. Bakteriospermia taktiež ovplyvňuje funkcie mitochondrií (energeticko-metabolické centrum v bunke), čo vedie ku zvýšenej tvorbe ROS a fragmentácii DNA. Jedným z faktorov, ktoré sú zodpovedné za zlyhanie umelej inseminácie je kontaminácia zárodočnej plazmy patogénmi. Najčastejšie mikroorganizmy, ktoré kontaminujú spermie býkov pochádzajú z rodov Corynebacterium, Staphylococcus, Micrococcus, Bacillus, Escherichia, Pseudomonas, Klebsiella, Streptococcus a Enterobacter. Tieto patogény spôsobujú nielen zníženie fertilizačnej schopnosti spermií ale môžu infikovať aj urogenitálny trakt samice počas umelej inseminácie. Ďalšie faktory, ktoré podporujú vznik bakteriálnej kontaminácie je nesprávna manipulácia, preprava alebo skladovanie kryoprezervovaných vzoriek (Sisay a kol., 2012; Reda a kol., 2020). Patogény sú lokalizované v pohlavnom ústrojenstve býkov, pričom kontaminujú ejakulát a moč. Podieľajú sa aj na výskyte chorôb ako sú pyelonefritída (akútny zápal obličiek) a cystitída (akútny zápal močového traktu) hovädzieho dobytka. Mnohé štúdie potvrdzujú najmä kontamináciu aeróbnymi baktériami, ktoré boli identifikované v rozmrazenom ejakuláte. Súčasný výskum potvrdzuje, že kryokonzervácia nezabraňuje vzniku bakteriálnej kontaminácie vo vzorkách preto je nutné dôkladne dodržiavať hygienické opatrenia a sterilitu počas odberu, prepravy, spracovania a skladovania vzoriek ejakulátu (Morell, 2006).
Kryokapacitácia
Za fyziologických podmienok spermie podliehajú sérii biochemických a morfologických zmien, ešte pred akrozómovou reakciou. Tento proces sa nazýva kapacitácia, za fyziologických podmienok prebieha až v pohlavnom trakte samice, kde prostredie prirodzene stimuluje nástup tohto procesu. Kapacitácia je úzko prepojená s hyperaktiváciou spermie, kedy dochádza k zmene charakteru pohybu u spermií – zrýchľujú svoj pohyb intenzívnejším kmitaním bičíka. Ďalšie zmeny zahŕňajú odbúranie cholesterolu z bunkovej membrány, hyperpolarizáciu plazmatickej membrány (zmena membránového potenciálu), zmenu pH a koncentrácie vápnika. Po týchto zmenách sú spermie schopné chemotaxie a termotaxie, čo im umožňuje aktívne vyhľadať vajíčko, interagovať s ním a aktívne podstúpiť akrozomálnu reakciu (Ickowicz a kol., 2012) . Kryokonzervácia nielen spermií býkov je dôležitým nástrojom asistovanej reprodukcie, avšak kvalita rozmrazených vzoriek je často krát znížená v priemere o polovicu v porovnaní s „čerstvou“ nemrazenou vzorkou. Tým že spermie sú počas mrazenia vystavené nízkym teplotám, dochádza k destabilizácii bunkovej membrány, strate povrchových proteínov, poklesu pohyblivosti, životaschopnosti, mitochondriálnej aktivity a zvýšeniu produkcie ROS. Kryokapacitácia je vyvolaná pôsobením nízkych teplôt počas kryokonzervácie, pričom napodobňuje priebeh prirodzenej kapacitácie. Kontraindikácie sprevádzajúce kryokapacitáciu sú charakteristické prestavbou bunkovej membrány, stratou cholesterolu a polynenasýtených mastných kyselín, ktoré hrajú dôležitú úlohu v zachovaní prirodzenej fluidity a integrity bunkovej membrány. Spermie sú teda často krát v kapacitovanom stave už pred samotným oplodnením, dochádza teda ku strate energie potrebnej na úspešný priebeh oplodnenia (Talukdar a kol., 2017; Ledesma a kol., 2019) .
Toxické pôsobenie kryoprotektantov
Kryoprotektanty sa vo všeobecnosti delia na membránovo priepustné a nepriepustné. Slúžia ako rozpúšťadlá používané pri konzervácii spermií počas mrazenia, pričom im poskytujú ochranu pred kryogénnymi teplotami. Medzi membránovo priepustné zaraďujeme glycerol, dimetylsulfoxid (DMSO), dimetylacetaldehyd, propylén a etylénglykol, ktoré prechádzajú membránami buniek a nahrádzajú tak vodu. Ich nevýhodou je, že ide hlavne o látky syntetického pôvodu, ktoré vo vyšších koncentráciách pôsobia toxicky a dramaticky tak znižujú fertilizačný potenciál spermií. Tieto látky negatívne ovplyvňujú viskozitu cytoplazmy, menia rýchlosť difúzie a vlastnosti bunkovej membrány zmršťovať sa pri nízkych teplotách (Amirat a kol., 2009; Kumar a kol., 2012) . Druhú skupinu membránovo nepriepustných kryoaditív tvoria rafinóza, sacharóza, vaječný žĺtok, citrát a albumín. Ich mechanizmus účinku spočíva v zmrazení vonkajšieho (extracelulárneho) priestoru okolo buniek a ochrane vnútrobunkových štruktúr a organel (Sieme a kol., 2016).
Zhrnutie
Kryokonzervácia síce umožňuje uchovávať genetický materiál ale sú s ňou spojené aj riziká, ktorým sú bunky vrátane spermií vystavené pred zmrazením, počas neho a po ňom. Kryogénne poškodenie častokrát vedie k fyziologickým, morfologickým a biochemickým zmenám samčích gamét, čo znižuje kvalitu a fertilizačný potenciál rozmrazenej vzorky pre účely umelej inseminácie. Preto je nutný podrobný výskum zmien, ktorými bunky prechádzajú počas krykonzervácie aby bolo možné zredukovať alebo úplne eliminovať ich nepriaznivý vplyv. Aj napriek tomu však kryouchovávanie zastáva dôležitú úlohu pri konzervácii a ochrane genetického materiálu plemenných býkov a zabezpečuje tak distribúciu kvalitného hovädzieho dobytka.
Poďakovanie
Táto publikácia vznikla vďaka podpore v rámci Operačného programu Integrovaná infraštruktúra pre projekt: Tvorba nukleových stád dojníc s požiadavkou na vysoký zdravotný status cestou využitia genomickej selekcie, inovatívnych biotechnologických metód a optimálneho manažmentu chovu, NUKLEUS 313011V387, spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja.
Použitá literatúra je k dispozícii u autorov.
