Úvod / Informácie / Rastlinná výroba / Vinič a víno

Birzotvorné kvasinky a ich výskyt vo vínach

16-01-2018
RNDR. Attila Kántor, PhD. | xkantora@uniag.sk
Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre

Úvod

Vieme, že kvasinky sú pri výrobe vína jeho neodmysliteľnou súčasťou, a preto vinári často využívajú ich potenciál „prekvasiť“ cukry v mušte, z ktorých vzniká etanol, oxid uhličitý a uvoľňuje sa teplo. Pri výrobe vína je dôležité zabezpečiť anaeróbne podmienky (bez prístupu kyslíka) pre samotný proces kvasenia, aby sa mohol prejaviť potenciál len tých kmeňov kvasiniek, ktoré chceme použiť. Najčastejšie sa k tomuto účelu používajú ušľachtilé kmene kvasiniek Saccharomyces cerevisiae, ktoré bezpečne za anaeróbnych podmienok skonzumujú cukry a produkujú etanol spolu s ďalšími produktmi, ktoré vo finále predstavujú základ pre sekundárny buket samotného vína. Všetko však nefunguje bez problémov ani pri výrobe vína. Pokiaľ sa nedodržia základné postupy pri výrobe, môžu sa rozmnožiť také druhy kvasiniek, ktoré vínu skôr škodia. Medzi najznámejšie patria takzvané birzotvorné „kožkotvorné“ kvasinky.

Birzotvorné kvasinky

Birzotvorné kvasinky zaraďujeme medzi striktne aeróbne druhy (vytvárajú birzu len za prítomnosti kyslíka) so slabým fermentačným metabolizmom, ktoré za prítomnosti kyslíka vytvárajú na hladine vína bielo-šedú blanu (birzu). Za vznikom birzy je tvorba pseudomycélia na hladine vína (materské bunky ostávajú spojené s dcérskymi, bunky sa predlžujú). Pseudomycélium vytvárajú kvasinky za aeróbnych podmienok. V tomto prípade začínajú kvasinky víno znehodnocovať a to tak, že produkujú acetaldehyd a znehodnocujú aromatický profil vína. Acetaldehyd sa viaže na oxid siričitý a tým sa jeho antimikrobiálny a antioxidačný účinok rapídne znižuje. Senzoricky sa vysoký obsah acetaldehydu (nad 100 mg.l-1) prejavuje nepríjemnou arómou po odlakovači. Okrem toho sa popri birzotvorných kvasinkách môžu rozmnožovať aj octové baktérie, ktoré svojou prítomnosťou oxidujú etanol až na kyselinu octovú čo vedie k zvýšeniu obsahu prchavých kyselín vo víne. Medzi birzotvorné kvasinky zaraďujeme hlavne rody Pichia a Candida. Najväčší problém nastáva vtedy, keď je víno dlhšiu dobu vystavené vzdušnému kyslíku, nachádza sa v nedoliatych sudoch, skladuje sa pri vyššej teplote prípadne je nevhodne zasírené. Víno je možné chrániť proti rastu týchto kvasiniek najmä adekvátnym množstvom voľného oxidu siričitého (SO2) (25-30 mg.l-1), nízkou teplotou skladovania 8-12 °C a pravidelnou kontrolou vína. Pokiaľ sa z plného skladovacieho tanku víno uvoľní, vzniknutý vzduchový priestor sa vyplní dusíkom. Medzi najznámejšie druhy birzotvorných kvasiniek patrí Pichia membranifaciens (anamorfa Candida valida), Pichia manshurica, Wickerhamomyces anomalus (Pichia anomala je synoným), Cyberlindnera jadinii (Pichia jadinii je synoným) Kregervanrija fluxuum (anamorfa Candida vini) atď. Anamorfa je asexuálne štádium, kedy sa kvasinky v prostredí množia len nepohlavne – pučaním. Opakom je teleomorfa – štádium sexuálne (pohlavné), kvasinky sa rozmnožujú redukčným delením meiózou. Pichia manshuricaP. membranifaciens sú veľmi častými kontaminantmi nefiltrovaných vín (obr. 1).

Obr. 1: Birzotvorné kvasinky rodu Pichia a osmotolerantný druh Z. bailii

Obr. 1: Birzotvorné kvasinky rodu Pichia a osmotolerantný druh Z. bailii
(foto: Kántor, 2017)

Spolu s týmito druhmi kvasiniek sa môže vyskytovať aj extrémne odolný, osmotolerantný rod kvasiniek Zygosaccharomyces, alebo octové baktérie rodu Acetobacter. Druhy tohto rodu sú odolné voči slabým kyselinám (octová, benzoová, sorbová), proti SO2, CO2 a vysokému obsahu alkoholu (> 20 %). Ich makroskopická determinácia s následným odlíšením je pomerne jednoduchá na bežných živných médiách vhodných na kultiváciu kvasiniek. Na živných médiách vytvárajú okrúhle, alebo nepravidelné, spravidla matné, vráskavé, krémovo sfarbené kolónie s maslovým nádychom. Slabý, kyslý zápach po kyseline octovej je typický pre niektoré druhy rodu Pichia. Pichia membranifaciens (obr. 2), P. manshurica P. gulliermondii majú schopnosť produkovať do vína aj prchavé fenoly (4-etylfenol, 4-etylguajakol) vďaka indukovateľnej cinamát dekarboxylázy podobne ako kvasinky rodu Brettanomyces. Birzotvorné kvasinky je možné izolovať z nefiltrovaných a nezasírených vín alebo z vín, ktoré neprešli filtrom s pórovitosťou 0,2-0,45 µm pred samotným plnením do fliaš.

Obr. 2: Pichia membranifaciens pod mikroskopom

Obr. 2: Pichia membranifaciens pod mikroskopom
(foto: Kántor, 2017)

Izolácia birzotvorných kvasiniek

Vzorky sa asepticky odoberajú zo skladovacích tankov (sudov) do sterilných plastových fliaš s objemom od 100 do 500 ml. Po odbere sa vzorky skladujú v podmienkach so zníženou teplotou (6-8 °C) až do následného mikrobiologického rozboru. Pokiaľ chceme rýchlo zistiť prítomnosť birzotvorných kvasiniek, vzorka vína sa vystaví vzdušnému kyslíku a vyšším teplotám (25-28 °C). Pred samotným mikrobiologickým rozborom sa vzorky vín, ktoré boli aspeticky odoberané z tankov sa dôkladne premiešajú. Po premiešaní sa sterilne odpipetuje 1 ml vzorky a následne pridá k 9 ml sterilného fyziologického roztoku v skúmavke. Z tejto skúmavky sa následne po premiešaní obsahu odoberie 1 ml a pridá k ďalším 9 ml sterilného fyziologického roztoku. Takto sa postupuje až do výšky príslušného riedenia. Treba dávať pozor hlavne na to, že pri využití metódy priameho rozteru inokula nie sú výsledné riedenia rovnaké ako pri metóde zalievania inokula. V tomto prípade sa riedenia posúvajú o jedno riedenie. Napríklad pri metóde zalievania platí riedenie 10-2, ale pri metóde priameho rozteru je to 10-3. Vzorky vín je nutné riediť z dôvodu lepšieho vyhodnotenia výsledkov a ľahšieho morfologického rozlíšenia jednotlivých kolónií kvasiniek. Je veľmi vhodné použiť inokulum dvoch za sebou nasledujúcich riedení. Keďže chceme izolovať birzotvorné kvasinky, treba pamätať, že ide prevažne o aeróbne druhy, takže zvolíme metódu priameho rozteru vzorky na povrch stuhnutého živného média. Pri tejto metóde sa využíva 100 µl inokula príslušného riedenia, ktoré rozotierame sterilnou L-tyčinkou po povrchu stuhnutej živnej pôdy. V prípade postupu s využitím zalievania inokula ochladeným živným médiom (< 45 °C) sa používa 1 ml príslušného riedenia. Živných médií na kultiváciu kvasiniek je veľmi veľa. Základom je zdroj uhlíka, zdroj dusíka, prítomnosť vitamínov (mnoho druhov kvasiniek vyžaduje najmä vitamíny skupiny B). Do živného média je vhodné pridať látky s inhibičným účinkom proti rastu baktérií (chloramfenikol) a pH indikátor (brómkrezolová zelená pH 3,8-5,4, brómfenolová modrá pH 3,0-4,6) na lepšie odlíšenie druhov kvasiniek. Najjednoduchším živným médiom na kultiváciu kvasiniek je agar s glukózou, peptónom a kvasničným extraktom YEPD (YPD) [Yeast extract Peptone Dextrose]. Pripraví sa zmiešaním 10 g kvasničného extraktu, 20 g peptónu, 20 g glukózy a 15 g agaru v jednom litri destilovanej vody. Po sterilizácii autoklávovaním (121 °C/1,2 bar./15 min.) je živné médium pripravené na použitie. Ďalším veľmi často používaným živným médiom na kultiváciu kvasiniek je agar so sladovým výťažkom, MEA (Malt extract agar). Zvyčajne obsahuje špeciálny peptón pre mykológiu (5 g.l-1), sladový výťažok (30 g.l-1) a agar (15 g.l-1). Agar so sladovým výťažkom je možné vylepšiť prídavkom 3 g.l-1 kvasničného extraktu, 50 g.l-1 glukózy a 0,020 g.l-1 indikátora brómkrezolovej zelenej. Kvasinky sa kultivujú pri 25 °C po dobu 5 dní aeróbne. Po uplynutí doby kultivácie, sa vyrastené kolónie spočítajú a makroskopicky posúdi počet možných druhov. Pokiaľ sa do živného média použil pH indikátor rozlíšenie jednotlivých druhov je o to jednoduchšie. Každý kmeň kvasiniek má jedinečný potenciál pohlcovať pH indikátor v rámci svojich buniek, a tým je možné farebne odlíšiť nie len rody, druhy, ale dokonca aj kmene kvasiniek! Potenciálne rozdielne druhy kvasiniek sa zvyčajne preočkovávajú na nové živné médium z dôvodu efektívnejšej separácie jednotlivých druhov jednoduchým alebo zložitým čiarkovaním. Po inkubácii sa kvasinky uchovávajú pri zníženej teplote (6-8 °C), v roztoku glycerolu (30 %) alebo sa lyofilizujú. Pokiaľ sa uchovávajú na Petriho miskách pri znížených teplotách, dokážu pri dostatočnom množstve zásobných látok „prežiť“ 2 až 3 mesiace.