Kryokonzervácia vajíčok a oplodnenie in vitro u hovädzieho dobytka ako nástroje pre účely Banky živočíšnych genetických zdrojov
Pre ochranu genetickej diverzity ohrozených druhov a plemien je nutné vytvorenie banky živočíšnych genetických zdrojov samčích a samičích gamét a embryí. Významnou mierou k tomu môže prispieť produkcia embryí hovädzieho dobytka in vitro, ako perspektívna biotechnologická metóda zvyšujúca využiteľnosť reprodukčného potenciálu zvierat. Kryokonzervácia vajíčok (oocytov) v kombinácii s in vitro oplodnením (IVF) je kľúčová technológia, ktorá umožňuje tvorbu embryí in vitro (IVP) a ich transfer recipientkám v čase vyhovujúcom pre chovateľa. Okrem toho, in vitro produkcia embryí zo zmrazených oocytov môže významne prispieť k rozširovaniu a uchovávaniu genofondu ohrozených druhov alebo plemien zvierat, ktorých stavy sa výrazne znižujú. Avšak, embryá produkované in vitro neprežívajú kryokonzerváciu tak dobre ako embryá vyvíjajúci sa in vivo, čo znižuje úspešnosť gravidity kráv (jalovíc) po prenose embryí. Preto, zlepšovanie odolnosti IVP embryí voči zmrazovaniu je aktuálna výzva, ktorej riešenie prispeje k zefektívneniu použitia ďalších biotechnologických metód.
|
Obr. 1: Vaječníky kráv ako zdroj oocytov |
Problémom kryouchovávania in vitro produkovaných (IVP) embryí je ich znížená odolnosť voči zmrazovaniu v porovnaní s in vivo embryami. Embryá produkované metódou in vitro oplodnenia sa líšia od in vivo embryí, pričom rozdiely v kvalite súvisia so spôsobom ich produkcie. IVP embryá majú výrazne tmavšiu a nepriehľadnú cytoplazmu, čo je spôsobené morfologickými a ultaštrukturálnymi zmenami, hlavne nahromadením tukových kvapiek v cytoplazme. Vysoký obsah tukových kvapiek v cytoplazme je považovaný za jednu z hlavných príčin zlej zmrazovateľnosti oocytov a preimplantačných embryí niektorých druhov hospodárskych zvierat vrátane hovädzieho dobytka a ošípaných.
Zmrazovanie oocytov kráv (jalovíc) má za následok rôzne poškodenia: poškodenú vonkajšiu membránu oocytu, takzvanú - zona pelucida (ZP), fragmentovanú cytoplazmu, zle rozlíšiteľnú oolemu a zväčšený perivitelinný priestor. Ďalšie rozdiely medzi in vivo a in vitro embryami spočívajú v počte mitochondrií, ale aj v dynamike vývoja a expresii vývojovo relevantných génov, ako napriklad conexin 43 (Cx43), ktorý je zodpovedný za tvorbu medzibunkových spojení dôležitých pri kompaktizácii moruly a utváraní blastocysty.
|
Obr. 2: 2A a 2B Aspirácia folikulárnej tekutiny z vaječníka kravy |
Výber najvhodnejšieho metodického postupu zmrazovania gamét alebo embryí je podmienený celým radom faktorov ako sú vývojové štádium embrya, rýchlosť zmrazovania a rozmrazovanja (vitrifikácia alebo pomalé zmrazovanie), zloženie zmrazovacieho média a koncentrácia jednotlivých kryoprotektívnych látok.
Metódy zmrazovania oocytov musia zabezpečiť ich dobrú životaschopnosť po rozmrazení. Doposiaľ bolo navrhnutých viacero stratégií pri liečbe neplodnosti s využitím zmrazených oocytov alebo ovariálnych tkanív. Tieto stratégie popisujú zmrazovanie buď nezrelých oocytov izolovaných z vaječníkov, alebo dozretých - maturovaných (po ovulácii) oocytov. Zmrazenie a dlhodobé uchovávanie embryí je v súčasnej dobe lepšie rozpracované a úspešnejšie ako zmrazovanie oocytov. Oocyty sú veľmi citlivé na zmrazovanie, kvôli nízkemu pomeru povrchu k objemu, preto voda a kryoprotektívne látky (kryoprotektíva) nemôžu tak rýchlo prechádzať cez cytoplazmatickú membránu. Naviac, zmrazovanie maturovaných oocytov môže viesť k narušeniu meiotického vretienka a chromozomálnym abnormalitám. Zmrazovanie maturovaných oocytov (v štádiu - metafáza II) prináša variabilné výsledky vzhľadom na problémy, ktoré vznikajú počas oplodnenia a embryonálneho vývoja. Z uvedeného vyplýva, že preklenutie vysokej senzitivity oocytov voči zmrazovaniu si vyžaduje ďalšie výskumy. Použitie samotného morfologického hodnotenia oocytov po zmrazení nie je dostačujúce, pretože morfologická analýza nie je vždy v korelácii so životaschopnosťou a vývojovou kompetenciou oocytov. Tieto výsledky je potrebné overiť vývojom oocytov po ich oplodnení in vitro.
|
Obr. 3: Oocyty v Petriho miske |
In vitro oplodnenie a produkcia embryí hovädzieho dobytka in vitro je metóda zvyšujúca využiteľnosť reprodukčného potenciálu zvierat. V spojení s metódami kryokonzervácie a dlhodobého uchovávania embryí ponúka možnosť pozitívne ovplyvniť stavy ohrozených druhov, či plemien. In vitro produkcia embryí a následný embryotransfer prispievajú k zlepšeniu výsledkov reprodukcie a preklenutiu niektorých reprodukčných problémov vznikajúcich v chove vysokoúžitkových zvierat. Metodika je celosvetovo využívaná pre produkciu prenosuschopných IVP embryí hovädzieho dobytka, a ročne bolo, podľa Medzinárodnej Spoločnosti pre Embryo Transfer, prenesených recipientkam približne 411 000 IVP embryí hovädzieho dobytka (International Embryo Transfer Society, IETS, 2013). Väčšina z nich bola prenesená okamžite po vyprodukovaní, čo kladie vysoké nároky na organizáciu a synchronizáciu zvierat. Naproti tomu možnosť uchovať embryo pre neskoršie použitie prináša nesporné výhody. Preto, zlepšovanie odolnosti IVP embryí voči zmrazovaniu je aktuálna výzva, ktorej riešenie prispeje k zefektívneniu použitia ďalších biotechnologických metód, ako napríklad embryotransfer.
|
Obr. 4: Embryá kravy v ranných štádiách vývoja |
Myšlienka zlepšiť odolnosť in vitro produkovaných embryí nie je nová. Vo svete sa kryorezistenciou in vitro produkovaných (IVP) bovinných embryí zaoberá viacero výskumných pracovísk vo viacerých krajinách, kde takto získané embryá prispievajú k zlepšeniu reprodukčných výsledkov a preklenutiu niektorých reprodukčných problémov vznikajúcich v chove vysoko úžitkových zvierat. Cieľom zmrazovania IVP embryí je ich dlhodobé uchovávanie pre potreby neskoršieho použitia v embryotransferoch. K tomu je nevyhnutné dosiahnuť dobrú kvalitu týchto embryí. Kvalita embryí po rozmrazení je predpokladom dosiahnutia vysokého percenta gravidít u kráv po ich prenose. Až 90 % embryí sa hneď prenáša aj napriek nevýhodám a vysokým nárokom na organizáciu a synchronizáciu zvierat. Možnosť uchovať embryo pre neskoršie použitie prináša nesporné výhody, napriek tomu sa využíva málo, len približne 10 %, čo súvisí aj s nízkou odolnosťou (kryotolerancia) IVP embryí voči zmrazovaniu. Zvyšovanie tolerancie oocytov a IVP embryí voči zmrazovaniu je aktuálna výzva pre zvýšenie možností využitia iných biotechnologických postupov, predovšetkým in vitro produkcie embryí a embryotransferu. Tieto postupy môžu byť následne využité aj pri ochrane ohrozených plemien a zachovaní biodiverzity.
|
Obr. 5: Embryo kravy v štádiu blastocysty v konfokálnom mikroskope. Svetlo-zelenou farbou sú označene jadrá mŕtvych buniek, modrou – jadra zdravých buniek |
Na pracovisku NPPC VÚŽV Nitra (oddelenie genetiky a reprodukcie hospodárskych zvierat) sa aktuálne rieši projekt podporovaný agentúrou APVV, cieľom ktorého je optimalizovať metódy kryokonzervácie samičích vajíčok (oocytov) a in vitro produkcie embryí hovädzieho dobytka s cieľom vytvoriť embryá so zvýšenou odolnosťou voči zmrazovaniu pre potreby ich dlhodobého uchovávania v génovej banke živočíšnych genetických zdrojov. Vzhľadom na obmedzenú dostupnosť zdrojov reprodukčných tkanív od málo početných plemien zvierat (napr. pinzgauský dobytok), všetky metodické postupy a techniky sa vypracúvajú na biologickom materiáli (vaječníky) získanom z odporazených kráv (jalovíc) na lokálnych bitúnkoch. Naším cieľom je udržanie životaschopnosti oocytov počas dlhého časového obdobia. Okrem toho, výskum je zameraný hlavne na zlepšenie kvality embryí vyprodukovaných in vitro (IVP) z vitrifikovaných oocytov. Tieto embryá (blastocysty) pri ich následnom zmrazovaní musia byť tolerantné voči procedúre kryokonzervácie, aby boli vhodné pre dlhodobé skladovanie v génovej banke a pri ich rozmrazení mali dobrú preživateľnosť a vývojovú schopnosť. Aktuálny projekt je originálny aj tým, že naše pracovisko, ako jediné na Slovensku, sa zaoberá in vitro produkciou bovinných embryí. Technické a laboratórne vybavenie, ako aj viaceré optimalizované metodiky zmrazovania rôzneho biologického materiálu v tekutom dusíku (spermie, oocyty, embryá, kmeňové bunky, DNA) v prevádzke génovej banky živočíšnych genetických zdrojov na pracovisku NPPC VÚŽV OGRHz vytvárajú jedinečné podmienky pre riešenie danej problematiky, aplikačným cieľom ktorej je ochrana pôvodných slovenských plemien v podmienkach „ex situ in vitro“.
|
Obr. 6: Génová banka na pracovisku NPPC-VÚŽV Nitra |
Táto práca vznikla z podpory Agentúry pre Výskum a Vývoj (APVV) - grant č. APVV-19-0111.
Literatúra u autora.
